C&EN深度：蛋白靶向降解技术正在重定义小分子药物

▎药明康德/报道

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蛋白靶向降解 (targeted protein degradation) 是药物研发领域的一个新兴方向。自从人类基因组被解读以来，研究人员就在试图靶向成千上万导致疾病的蛋白。但是他们发现传统的小分子和抗体药物只能靶向大约20%的蛋白。这一局限性给了基于RNA的药物和基因编辑技术很大的发展空间，因为它们有可能靶向另外80%的蛋白。但是这些新技术也需要面对一系列挑战，其中包括药物递送问题，药效和安全性问题。蛋白靶向降解药物力图将小分子设计成为一种新型药物，传统小分子的作用是阻断蛋白的功能，而蛋白靶向降解剂的作用是通过将这些蛋白送入蛋白酶体 (proteasome) 将它们完全降解。近日《C&EN》杂志专门撰文对这种新兴药物的巨大前景进行了盘点。

蛋白靶向降解药物机理

我们的细胞一直在努力维持适当的蛋白水平，每一刻它们都在生成和降解成千上万种蛋白。维持蛋白平衡的关键因子是一个称为泛素 (ubiquitin) 的小蛋白。当它被链接到蛋白上后，它会导致这些蛋白被运送到蛋白酶体中进行降解。

▲泛素蛋白的图示（图片来源：By Rogerdodd (Own work) [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons）

开发蛋白降解药物的研究人员希望能够利用泛素-蛋白酶体的降解机制来改变导致疾病的蛋白的命运。为了达成这个目标，他们设计出一种具有两个活性端的小分子，一个活性端可以与靶向的蛋白相结合，而另一个活性端可以与称为E3泛素连接酶 (E3 ubiquitin ligase) 的蛋白相结合。这种双功能小分子能够强迫泛素与靶向蛋白相结合，将它们运送到细胞的垃圾处理站中。在蛋白被降解后它们可以继续靶向其它蛋白，从而迅速降低不需要的蛋白的水平。

▲蛋白发生降解的过程（图片来源：Kymera Therapeutics）

与传统药物不同，这些小分子的行为更像酶或者催化剂，一个小分子可以重复将多个靶向蛋白送入垃圾处理站。因此，它们不符合传统的药物效力和特异性的标准。最初，这些蛋白靶向降解分子只是学术研究领域中的新奇事物，但是随着一系列学术论文表明在细胞中靶向降解是消除错误蛋白的有力手段，生物医药产业开始对这项技术产生浓厚的兴趣。自2016年以来，多家专注于蛋白降解的生物技术公司出现并且获得大笔资金。同时大型医药公司开始启动内部研发并且达成各种合作协议来探索这种新的成药方式。下面我们来回顾一下蛋白降解从学术领域的新奇事物转变为热门领域的历程。

从新奇事物到热门领域

虽然风投和大型医药公司对蛋白靶向降解有着大量关注，但是这个概念并不新颖。在上世纪90年代末就有一家名为Proteonix 的生物技术公司递交了关于使用双功能分子利用细胞泛素系统的专利。与此同时，耶鲁大学 (Yale University) 的化学生物学家Craig Crews博士和加州理工大学 (California Institute of Technology) 的细胞生物学家 Raymond Deshaies博士也发表学术论文表明类似多肽的小分子可以导致蛋白降解。但是这些化合物没有能够成药的特性，因此并没有得到生物医药产业的重视。

▲耶鲁大学的化学生物学家Craig Crews博士（图片来源：耶鲁大学）

在2008年，Crews博士组建了一支由化学家和生物物理学家构成的团队来进一步推动这方面的研究，他们的目标是开发出第一个具备催化特征的小分子药物，他称之为“PROTACs”，代表蛋白降解靶向嵌合物 (proteolysis-targeting chimeras)。

Crews的研究团队面对的一个关键性挑战是找出一个能够与E3连接酶结合的活性端，它使将泛素加载到蛋白上成为可能。但是利用E3连接酶通常意味着扰乱一个多蛋白复合体，这是一个历史悠久的难题。

▲PROTAC技术的图示（图片来源：耶鲁大学）

在2015年，两组发现激发了现在业界对蛋白降解的狂热追逐。当时在丹娜·法伯癌症研究所 (Dana-Farber Cancer Institute) 工作的Jay Bradner博士率领的化学生物学团队在《科学》杂志上发布了一种能够与名为cereblon的新E3连接酶结合的创新小分子降解剂 (Science 2015, DOI: 10.1126/science.aab1433)。同时， Crews博士的团队也发布了他们自己开发的小分子降解剂 (ACS Chem. Biol. 2015, DOI: 10.1021/acschembio.5b00442)。

投资者开始关注这一领域。“这一领域技术的日渐成熟和能够利用这一技术探索人类蛋白组中剩下的85%的可能性是令人无法抗拒的组合，” Kymera Therapeutics公司的创始人兼首席技术官Nello Mainolfi先生说。该公司是Altas Ventures在2015年开始帮助建立的专注于蛋白降解的生物技术公司。

Crews博士在两年前已经创建了Arvinas公司来进行PROTACs的商业化。在2016年，Bradner博士和其它学术研究人员创建了C4公司并获得7300万融资。这两家公司迅速与默沙东 (Merck)，辉瑞 (Pfizer) 和罗氏 (Roche) 等大型医药公司达成合作关系。

同时，包括诺华 (Novartis) 和阿斯利康 (AstraZeneca) 在内的其它大型医药公司开始对蛋白靶向降解进行投入。Bradner博士在2016年加入诺华并且领导该公司包括200多名化学家、生物学家和计算机科学家构成的蛋白降解研发组。

重新定义小分子药物

随着更多的公司涌入这一领域，他们需要重新思考小分子药物的设计。构建一个蛋白降解剂需要慎重考虑组成它的每个部件：包括与蛋白结合的配体，与E3连接酶结合的活性端，和连接两者的化学链。

完全组装起来后，这些分子违反了很多药物化学领域最神圣的信条，其中最著名的是药物化学家Christopher A. Lipinski博士提出的五规则。这是预测一个分子能否成为好的口服药物的一系列指标。按照这些规则，蛋白降解剂分子量过大，而且有太多氢键供体和受体。

▲一些潜在的蛋白降解药物（图片来源：《C&EN》）

蛋白降解剂不但看起来不会是好药物，而且在药物的结合能力，特异性和剂量等概念上与传统观念也出现了偏离。通常药物化学家们希望设计出一个分子，特异性地与靶点牢牢地结合在一起。他们的思维方式是最大化药物与蛋白结合的时间。

但是对蛋白降解剂功能的衡量标准不是它们与蛋白的结合有多紧密，而是双功能分子能够以多快的速度将各个蛋白连接起来，让靶向蛋白能够被泛素标记并且运送到蛋白酶体中。这一从结合热动力学 (binding thermodynamics) 向反应动力学 (reaction kinetics) 的转变是让人们对蛋白降解剂靶向以前无法成药的靶点寄予厚望的原因。

这些分子的末端不需要结合到关闭蛋白功能的蛋白域，它们只需要与靶点结合足够长的时间完成泛素标记的过程。虽然75%的蛋白缺少让传统小分子抑制剂结合的位点，但是 “如果你仔细观察它们的表面，它们还是有很多角落和缝隙” 让蛋白降解剂与之结合，耶鲁大学的Crews博士说。

而且有证据表明这种分子中与靶点蛋白结合的部分不需要传统小分子药物所需要的选择性。药物开发人员通常希望他们开发的分子只与想要结合的靶点相结合，因为与其它蛋白相结合的药物可能导致毒副作用。但是学术界的研究人员反复证明选择性不强的抑制剂可以变成特异性很高的蛋白降解剂。这种选择性产生的原因还没有被完全解释清楚，但是研究人员指出泛素标记的过程需要降解剂能够在合适的时间扭曲成合适的形状。

对于小分子抑制剂来说，“结合能力是所有问题的关键，” 诺华公司的Bradner博士说：“但是蛋白降解过程包括了多个机械步骤。你需要完成的是一个催化循环。”

向未知进军

即便研究人员在设计蛋白降解剂时不再需要遵守以前的药物化学规则，这并不意味着靶向人类蛋白组的降解剂一下子变得唾手可得。

“从定义上来说，一个 ‘无法成药’的蛋白靶点是不能用小分子来靶向的，” 加州大学伯克利分校的化学蛋白组学专家Daniel Nomura博士说。目前发表的双功能分子结合的靶点蛋白都是已经被研究得很透彻的具备高亲和力靶点的蛋白。例如，Arvinas公司今年将推入临床试验的两种蛋白降解分子的靶点都是被充分研究过的蛋白。一个是雄激素受体，它是前列腺癌的靶点，另一个是雌激素受体，它是乳腺癌靶点。迄今为止，还没有任何实验室公开发布一个靶向无法成药靶点的强力分子。

▲Arvinas的研发管线（图片来源：Arvinas官方网站）

研究人员正在采用多种手段来寻找与这些困难靶点相结合的配体。Nomura博士的实验室开发了一种方法能够使用共价小分子来探索蛋白表面，寻找能够与之结合的部位。“我们发现的许多位点从静态晶体结构的角度看来都不是显而易见的位点，”他说。

生物技术公司指出DNA编码化合物库可能是寻找蛋白降解剂的最佳起点。高通量筛选找出的是调节蛋白活性的化合物，而DNA编码化合物库找出的是与蛋白相结合的分子。这项技术让生物技术公司可以筛选上百万，甚至几十亿种携带DNA标签的化合物，从中找出与蛋白结合的先导化合物。Arvinas公司生物学负责人Ian Taylor先生指出，DNA编码化合物库不但能够帮助找出与蛋白结合的化合物，而且DNA标签是构建蛋白降解剂中链接部分的自然起点。

另外一种发现与蛋白结合分子的方法是重新审视那些已知可以与蛋白靶点相结合但是出于其它原因无法成药的化合物。它们可能包括以前的候选药物，它们可能不够强力或者有脱靶效应，但是理论上这些分子可能成为蛋白降解剂的一部分。

除了发现能够与以前无法成药的蛋白结合的配体以外，研究人员也希望能够对双功能分子的另一端进行改良。虽然人类泛素-蛋白酶体系统包括了超过600种E3连接酶，科学家们目前只找到能够与几种E3连接酶结合的配体。

研究人员希望能够发现与其它E3连接酶结合的配体，这将扩展蛋白降解剂的能力。例如，发现与只在特定组织中起作用的E3连接酶相结合的配体将帮助药物开发人员设计出更好的药物。

“发现打开大自然E3连接酶收藏的钥匙将是这一领域的重要中期目标之一，” C4 Therapeutics公司的主席兼首席科学官Andy Phillips先生说。

展望未来

如果研究人员想要探索人类蛋白组中的更多蛋白的话，它们需要将药物研发过程工业化。在蛋白降解剂研究初期，发现的分子大多是经验主义的结果。“我们显然需要将这一领域带入基于结构的药物设计的现代化时代。” 邓迪大学 (University of Dundee) 的Alessio Ciulli博士说。

▲Ciulli博士课题组解析了蛋白降解药物与靶点结合的晶体结构（图片来源：Ciulli博士实验室）

风投资金的涌入和大型医药公司的重视将帮助这一现代化过程的进行。“我们在尽力去除这项技术中经验主义的部分，”Kymera公司的CEO Laurent Audoly 先生说。他补充道该公司已经建立起一个药物研发平台来设计出出色的分子。

用理性进行药物设计，不但对加快药物研发过程非常重要，而且可以帮助理解我们应该着重研究哪些靶点。目前的现实情况是化学家们无法预测哪些蛋白可以被降解，也不知道它们能否进入一些如大脑那样的难于进入的组织。

除了了解哪些蛋白可以被降解以外，研究人员需要解决一个蛋白是否应该被降解的问题。这些双功能分子 “可能在体内产生深远的影响，“ BenevolentAI公司的药物研发副总裁Ian Churcher先生说：”如果药理学给与你的是药效，那当然是很好的事，但是如果药理学给你的是毒性，那就很糟糕了。”BenevolentAI公司力图使用人工智能分析工具来找出哪些靶点具备最大可能在治疗疾病的同时不产生危险的副作用。

虽然研究人员指出这一领域仍然有很多工作需要完成，但是他们同时也非常高兴蛋白降解剂将进入临床试验的阶段。观察这些分子能否安全地在人体中降解蛋白将是“验证这些分子能不能成为药物的第一个信号”， C4公司的Phillips先生说。

Arvinas公司希望它的靶向雄激素受体的PROTAC能够在今年十月开始临床试验。靶向雌激素受体的候选药物可能在年底进入临床试验。

研究人员对蛋白降解剂的未来充满信心。“自从我加入诺华以来，我们的科学家们已经成功降解了超过30种蛋白，“ Bradner博士说：“只要有许多化学和一点点运气，我们可以降解几乎任何蛋白！”

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参考资料：

 [1] Targeted protein degraders are redefining how small molecules look and act